酶底物法檢測糞便中大腸菌群的原理及操作流程

摘要：在地表水中水質環境監測糞大腸菌群具有重要的作用。而酶底物法檢測糞大腸菌群具有較準確、速度快、操作簡單等特點，是一項新的技術。

1、方法原理

在特定溫度下培養(yang) 特定的時間, 糞大腸菌群能產(chan) 生酶底物法采用大腸菌群細菌能產(chan) 生β-半乳糖苷酶, 將選擇性培養(yang) 基中的無色底物鄰硝基苯β-D-吡喃半乳甘糖分解黃色的鄰硝基苯酚, 在紫外燈照射下產(chan) 生熒光。統計陽性反應出現的數量, 查MPN圖表, 在將其計算出樣品中糞大腸菌群的濃度值。其酶底物法檢出限是10MPN/L。

2、實驗室用水

實驗室用水為(wei) 無菌水, 取來適量的純淨水, 放在燒杯中, 經過121攝氏度, 高壓蒸汽滅菌, 需要20分鍾。

3、采樣瓶的清洗準備

(1) 是新購買(mai) 的500ml具旋帽或者是磨口塞得廣口玻璃瓶, 應在百分之二的鹽酸中浸泡幾個(ge) 小時, 還需要用自來水衝(chong) 洗幹淨, 再用純淨水清洗1-2次, 控幹, 備用。

(2) 將清洗幹淨幹燥的采樣器, 用專(zhuan) 用的紙包裹起來, 放入恒溫幹燥箱內(nei) , 將溫度設置到121攝氏度, 滅菌20分鍾, 烘幹。滅菌完成後, 還需要關(guan) 閉實驗室電源待溫度降到50攝氏度以下時, 方可開門取樣品瓶, 不然, 玻璃瓶會(hui) 因為(wei) 操作不當爆裂。

4、樣品的采集及保存

(1) 單獨采樣, 優(you) 先采樣。使用已經準備好的采樣瓶, 采樣。在采樣的過程中產(chan) 樣瓶不用再進行衝(chong) 洗。

(2) 在同一采樣點進行分層采樣時, 應自上而下進行采樣, 以免不同層次的攪擾。

(3) 水樣的保存條件及時間:水樣應在10攝氏度以下冷藏保存;應盡快分析, 最長時間不能超過6個(ge) 小時。

(4) 化驗員接樣後, 不能立即檢測, 應將樣品與(yu) 4攝氏度以下冷藏並在2小時內(nei) 檢測。

5、分析樣品

5.1、樣品稀釋

需要根據樣品汙染程度確定接種量, 避免接種樣品培養(yang) 後97孔定量盤出現全部陽性或全部陰性。在接種量小於(yu) 100ml的時候, 應稀釋樣品後再進行接種試驗, 接種量為(wei) 10ml的時候, 取10ml樣品加入到90ml無菌水的三角瓶中混合均勻製成1:10的稀釋樣品, 其他接種量的稀釋樣品依次類推。在未知樣品, 可選用多個(ge) 接種量進行檢測。

5.2、接種

量取100ml樣品或是稀釋樣品與(yu) 滅菌後的三角瓶, 再加入2.7克+-0.5克培養(yang) 基粉末, 在充分攪拌混勻, 等完全溶解, 在將其全部倒入97孔定量盤內(nei) , 以手扶平97孔定量盤背麵, 趕出孔內(nei) 氣泡, 然後, 用程控定量封口機封口。觀察97孔定量盤顏色, 若出現類似或者深於(yu) 標準陽性比色盤的顏色, 則還需要進行樣品排查、培養(yang) 基無菌水等一係列因素後, 終止實驗或重新實驗。

5.3、培養(yang)

測定糞大腸菌群時, 將封口後的97孔定量盤, 放入恒溫培養(yang) 箱中, 在44.5攝氏度+-0.5攝氏度下, 培養(yang) 24小時。

5.4、對照實驗

(1) 空白對照

每次實驗都要用無菌水按照分析步驟進行實驗室空白測定。培養(yang) 後的97孔定量盤不得有任何顏色, 不然, 該實驗失敗, 應重新測定。

(2) 陽性與(yu) 陰性對照

將糞大腸菌群標準菌株製成300-3000個(ge) /ml的菌懸液, 將菌懸液按接種和培養(yang) 要求操作, 陽性菌株應呈現陽性反應;陰性菌株應呈現陰性反應;否則, 結果無效, 實驗失敗, 重新測定。

(3) 結果判讀及計數和有效位數的要求

將培養(yang) 24小時的97孔定量盤進行結果讀數, 樣品出現變黃色判斷為(wei) 糞大腸菌群陽性。測定結果保留2位有效數字。

5.5、結果計算與(yu) 表示

從(cong) 97孔定量盤法MPN表中查的每100ml水樣中糞大腸菌群的MPN值, 在根據樣品稀釋度不同, 按照公式換算樣品中糞大腸菌群濃度。

結語

本文通過對糞大腸菌群檢測方法酶底物法以其操作簡便、檢測周期短將在未來取代多管發酵法、濾膜法等傳(chuan) 統方法, 尤其是酶底物法采用密封培養(yang) 技術。